行政院衛生署
衛生署疾病管制局
台灣感染症醫學會
中華民國醫事檢驗學會
中央健康保局
 

抗生素抑(殺)菌效果的體外測試

 

陳怡心1 莊銀清1,2

奇美醫學中心 1醫學研究部 2內科部

前 言

臨床上用來評估某特定抗生素對病原菌的療效,在體外(in vitro)最直接方便的測 定方式,即是測定菌株抗生素感受性。體外試驗有非 常多種,舉凡紙錠擴散試驗(disk-diffusion test) 、最低抑菌濃度測定 (minimum inhibitory concentration; MIC)、最低殺菌濃度測定 (minimum bactericidal concentration; MBC)、棋盤格殺菌試驗 (checkerboard test)、殺菌時間曲線試驗(time-kill curves test)。每 個地區使用抗生素狀況和其它地區並不完全相同,因此本土菌株抗藥 性狀況可能會與其它地區有差異,不適合完全依據國外用藥經驗,國 內有必要監視菌株抗生素感受性狀況。依據美國臨床微生物檢驗室標 準委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards; NCCLS)指出紙錠擴散試驗是使用最普遍和快速的方法,但紙錠擴 散試驗技術並不是最好的方法,它之所以被普遍採用是因為簡單與經 濟。紙錠擴散試驗僅能提供定性資料,對大多數感染的治療可提供適 當的指引[1],然而當治療藥物劑量必須調整、試驗結果模稜兩可時 則必須操作能有定量資料的感受性試驗-即MIC,依據NCCLS標準執行 抗微生物劑感受性試驗方法測定。所以適當的實驗室體外試驗提供抗 生素MIC值,不僅知道抗生素對病原菌的最小抑制濃度,還可再以 time-kill test配合抗生素MIC的範圍,觀察不同的抗生素及不同的抗 生素濃度對病原菌生長抑制的情形,並且可以有助於臨床醫師用藥的 參考,再者若發現體外試驗的結果抗生素對病原菌有良好的抑制情況,將可進一步提供MIC值初步來作為動物實驗的設計(如圖一)。

MIC試驗-(agar dilution的材料與方法)

將各種抗生素加入Mueller-Hinton medium中,分別配成不同 標準濃度(0.00375μg/mL-128μg/mL)的MH plate。將所試驗的病原菌接種於MH broth培養37℃,隔夜後 取100μL於增殖試管培養基(Tryptone soy broth; TSB)增菌,增菌 後在配製好含有不同濃度抗生素的MH plate上點菌,進行MIC試 驗。判讀MIC值以不長菌的抗生素MH plate為準。若病原菌有許多 株時則需要計算MIC50和MIC90值(將所有測試菌的 MIC值由低至高排列,可以抑制一半或90%菌數的MIC,即為MIC50及MIC90)。 操作MIC試驗必須同時 也執行標準 菌株(例如E. coli 25922之MIC)來比對抗生素的準確性範圍,看是否與NCCLS所 提供的相同[2]。

MIC50和MIC90

MIC50是 指可以抑制百分之五十測試菌之最低抗生素濃度

MIC90是指可以抑制百分之九十測試菌之最低抗生素濃度

MIC和接種菌量效應(inoculum size effect)關係:

臨床上感染的病原菌以體外試驗所測得的MIC值為參考來治療 病人時,經常發現效果不佳,原因在於這類病原菌在較高菌量下具有 較高的MIC值,這是因為這類細菌對於某些抗生素具有接種菌量效 應(Inoculum size effect)現象。這時需要在體外試驗操作中提高接種 菌量,在操作Time-kill試驗時一般接種菌量為5×10 5CFU/mL,若發 現可能有inoculum size effect現象時,則需要提高菌量到5×10 7 CFU/mL來操作,所測得的MIC值才能模擬病人身上的狀況。

在實驗室中,操作MIC試驗亦可提供動物實驗上的設計。首先 必須先試驗選用的抗生素對病原菌的最小抑制濃度,以此來推算在動 物體內所給予的藥量。但是抗生素在體內作用反應的情形常常很難去 評估是否能完全抑制病原菌,抗生素的選擇和病人的預後受到許多因 素影響,包括抗生素藥物動力學性質、藥物毒性和病人身體狀況等。 其中藥物動力學:藥動學(pharmacokinetics; PK)/藥效學 (pharmacodynamic; PD)依據抗生素作用方式主要分為濃度依賴殺 菌(concentration-dependent killing)和時間依賴殺菌(time-dependent killing)二種;一個是要把藥量維持在MIC濃度之上讓在有效濃度的作 用下提高MIC,另一個是延長藥物在體內作用時間[3]。皆有提供MIC在動物實驗上 價值的所在,進一步若要看抗生素合併情形可再操作 Time-kill輔助動物實驗。

Checkerboard試驗-(broth microdilution的材料與方法)

為一種測試抗生素合併使用 效果的體外試驗,在96孔洞中操作肉湯 微量稀釋方法(如)。(一)把待測的某二種抗生素A及B各別稀 釋好不同濃度的MIC範圍。(二)在96孔洞中加入抗生素A及B依不 同MIC濃度, 各25μL合併混合均勻。(三)另調50μL菌液(濃度約 1×10 6 CFU/mL)加 到96孔洞中,使每個孔洞總體積為100μL。(四)置於 37℃培養箱培養隔夜後, 判讀其合併抑制濃度的範圍。由此合併抑制範 圍可求出微量抑制濃度指數(fractional inhibitory concentration index; FIC index)[4]。此公式用以初步測試某二種抗生素A及B合併是否 具有協同性作用(synergy)、加成性作用(additive)、無效性作用 (indifference)、拮抗性作用(antagonism)(如表一)。

Fractional Inhibitory Concentration(FIC):

FICA=MIC of drug A in combination/MIC of drug A alone

FICB=MIC of drug B in combination/MIC of drug B alone

FICindex=FICA+FICB

Time-kill curves試驗-(broth macrodilution的材料與方法)

為一種肉湯大量稀釋方法,先以agar dilution的方式初略估計所 測試的抗生素對病原菌的MIC值,再依照不同MIC值範圍配合不同 抗生素合併進行Time-kill,接種菌量約為5×10 5CFU/mL。之後在各 個時間點0、2、4、6、8、12、24、30、36、 48小時,塗菌液在LB agar plate上,置於37℃培養箱培養24小時最後菌落數以log10/CFU表示 畫成曲線圖[5](如圖三)。

Time-kill curves與後抗生素效應(post-antibiotic effect; PAE)關係 所謂PAE指的是細菌與抗生素短暫接觸後在抗生素被清除的情 況下細菌生長仍受抑制的現象。研究發現許多抗生素的抗菌活性與藥 物的高峰濃度密切相關,有明顯的濃度效應,體內抗生素不必始終維 持在有效血中藥物濃度之上。在PAE期中的細菌許多特徵產生了改 變,使得在治療中可以延長給藥間隔,減少用藥劑量。time-kill curve為抗生素 殺菌曲線,若此抗生素具有PAE現象可以觀察出細菌生長 抑制的現象。

結 論

以往對於病人感染時,臨床醫師常會依照經驗投藥或仰賴細菌室以Disk diffusion test做抗生素感受性試驗的 結果來治療病人病況。但是一旦遇 到抗藥性菌株或病人治療過程復發導致用藥劑量可能需要調整時, MIC試驗就顯得重要。如何把實驗室體外試驗操作的數據應用在 臨床上用藥的參考及動物實驗的設計,實為重要。首先在操作所有體 外試驗:MIC、Time-kill、Checkerboard、Disk diffusion時,必須結 果要差異不大且有臨床上的意義所在[6](表二)。倘若適時提供這些 體內試驗數據能幫助臨床醫師解決用藥的困擾和反覆投藥造成抗藥 性的問題時,這些實驗室試驗相對就有提供的價值所在。

參考文獻

1. 行政院衛生署:腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)之抗藥趨 勢。疫情報導2004;20:245-53.
2. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: Deterrmination of minimum inhibitory concenrations (MICs) of antibacterial agents by agar dilution. Clin Microbiol Infect 2000;6:509-15.
3. Ebert SC: Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antibiotic selection. Pharmacy Therapeutics 2004;29:244-53.
4. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: Terminology relating to methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. Clin Microbiol Infect 2000;6:503-08.
5. Ko WC, Lee HC, Chuang YC: In vitro and in vivo combinations of cefotaxime and minocycline against Aeromonas hydrophila. Antimicrob Agents Chemother 2001;45:1281-3.
6. White RL, Burgess DS, Manduru M: Comparison of three different in vitro methods of detecting: time-kill, checkerboard, and E test. Antimicrob Agents Chemother 1996;40:1914-8.


 
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