賴信志

長庚大學 醫學生物技術暨檢驗學系

以Sanger方法為主之DNA序列分析技術已廣泛應用於生物醫學研究領域。操作較為繁複及無法於一定時間內處理大量檢體，是此法的主要限制。近年來發展的pyrosequencing技術，具有在一定時間內可同時從事多個檢體及短DNA序列分析之特點，其各項應用正積極推廣中。

核酸DNA序列分析技術是現代生命科學的核心技術之一，廣泛使用於多項生醫研究及應用診斷之領域。目前使用最普遍的DNA序列分析技術是以雙去氧核?酸鏈終止法(dideoxynucletotide termination method)為基礎之Sanger方法。在Sanger方法的全自動DNA序列分析步驟中，DNA合成反應會產生一系列由短至長的螢光標記DNA片段，這些DNA片段經平板膠電泳(agarose gel electrophoresis)或毛細管電泳capillary
electrophoresis)程序被分離，接著螢光分子因雷射光的激發而放出螢光，此螢光信號被檢測系統(detector)檢測、記錄而轉讀出DNA序列。Sanger方法的特點為讀序能力較強，每次反應約可得到1,000個核?酸序列，因此可提供較多的DNA訊息；但相對的，其缺點為操作較複雜，以及不易於一定時間內分析大量檢體。雖然在很多情況中，我們對DNA序列分析的要求是讀序越長越好，但在相當多的分子診斷工作中，往往需在短時間內偵測很多DNA檢體，而且只需短短的幾十個核?酸序列的資訊，就可以提供正確診斷。例如：在臨床分子診斷領域中，對細菌和其他病原微生物的分子診斷，或在偵測單一核?酸多型性(single nucleotide polymorphism; SNP)時，只需對最具代表性的十幾到幾十個核?酸片段進行序列分析即可。在這種情況下，Sanger 方法未必是最合適的DNA序列分析技術。新發展的焦磷酸測序(pyrosequencing)技術，應該是目前最適合這些應用目的的DNA序列分析技術。

Pyrosequencing技術是新世代的DNA序列分析技術(next generation sequencing technology)，是針對短到中等長度的DNA序列樣品進行高通量、高精確度(99%精確)和再現性佳的分析技術。其DNA序列分析反應之原理不同於傳統Sanger方法，係利用幾種生化反應之組合來測定在DNA合成時，過程中會產生的焦磷酸基團(PPi)之特徵，進而將PPi轉換成ATP，ATP再促使螢光素?(luciferase)放出冷光(bioluminescenc)。此放出的冷光強度經冷光儀(luminometer)偵測後，轉讀出DNA序列。該技術特點包括：對DNA的序列分析無須進行電泳、DNA片段無須螢光標記(因此無須螢光分子的激發和檢測裝置)、及在96孔盤上進行反應，因此可同時進行多檢體序列分析。但也因反應特性的限制，精準讀序目前只在20-30個核?酸序列左右。有的研究者經過改良，可使該技術的讀序長度增加一倍以上。

Pyrosequencing的操作基本步驟如下(圖一，A)：

(一)利用PCR複製待測序的DNA。反應中PCR primer pair之一為生物素(biotin)所標記。

(二)經biotin標定之PCR產物與streptavidin偶連之sepharose微珠(streptavidin-conjugated sepharose beads)進行反應後被純化。

(三)DNA雙股經加熱變性而分開，成為pyrosequencing反應的待測單股DNA模板，之後和測序primer結合成雜交體。

(四)進行pyrosequencing序列分析反應：與DNA聚合?(DNApolymerase)、硫酸化?(ATPsulfurylase)、螢光素?(luciferase)、雙磷酸?(apyrase)和受質adenosine 5'-phosphosulfate (APS)、螢光素(luciferin)進行反應。

(五)四種dNTP (dATPS、dTTP、dCTP、dGTP)依序被加入反應體系中。在每一輪測序反應中，只加入其中一種。如被加入的dNTP與DNA模板配對，DNA聚合?就可以催化該dNTP與primer的3'端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團(PPi)就被釋放出來。加入的dNTP和釋放出來的PPi的莫耳(mole)數目是相等的。接著，ATP sulfurylase催化APS和PPi形成ATP，此ATP和PPi的mole數目也是一致的。利用ATP作為能源，luciferase可將螢光素氧化為氧化螢光素(oxyluciferin)，進而發出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機檢測，並由pyrogramTM轉為波形訊號(圖一，B)。每個波峰的高度(光信號)與反應中加入的核?酸數目成正比，例如：若加入dGTP的該次反應中，產生兩倍高的波峰，表示此處的DNA模板上的序列是兩個與G配對的C。之後，ATP由apyrase降解，消除光信號，並再生反應體系，然後就可以加入下一種dNTP。如被加入的dNTP與DNA模板不能配對，以上反應便不發生， dNTP由apyrase直接降解，然後進入下一個反應迴圈。隨著以上過程的迴圈進行，與DNA模板互補的DNA鏈合成，產生pyrogram的波形訊號，並轉為DNA序列。

瑞典Pyrosequencing AB公司基於pyrosequencing技術而研究開發的PSQ 96系統是一個理想的遺傳分析技術平臺，它既可進行DNA序列分析，又可進行SNP檢測及等位元基因頻率測定。實際執行pyrosequencing時，可經由生物資訊分析(bioinformatics analysis)，設計三條primers，其中兩條是成對的(兩條中的一條用biotin標記)，用來擴增一特定的標的DNA序列，第三條primer則作為pyrosequencing用。採用偶連streptavidin的微珠(Streptavidin SepharoseTM HP，Amersham Biosciences AB，Sweden)和PSQTM 96 Sample Preparation Kit(Pyrosequencing AB)及其相關方法將PCR雙股分離，轉移至PSQ 96 SQA Plate的含biotin primer的單鏈PCR產物和測序primer annealing。利用測序試劑盒SQA Reagent Kits (Pyrosequencing AB)和PSQ 96 DNA分析系統進行序列分析，結果用SQA軟體進行分析。商品化的Pyrosequncingkit之設計特性：(1)受質濃度已最佳化；(2)高品質的apyrase保證了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPαS；(3)dNTP降解速率慢於摻入速率，有利於dNTP充分摻入；(4)ATP合成速率快於ATP水解速率，使得ATP濃度和光產生正比於摻入的dNTP數目。

Pyrosequencing技術測序長度很短，只能偵測20-30個核?酸序列。但是和任何測序技術一樣，最大讀序長度取決於DNA模板的二級結構、核?酸組成、PCR產物品質等相關因數。為了增加信雜比(signal/noise ratio)，因為DNA polymerase對dATPS的催化效率比對dATP的催化效率高，且dATPαS不是螢光素?的受質，因此反應時加入deoxyadenosine alpha-thio triphosphate (dATPαS)作為dATP的替代物。但dATPαS是兩種異構體SpdATPαS和 RpdATPαS的混合物，聚合?只能利用SpdATPαS。因此，為了得到最佳反應效率，必需使反應體系中保持最佳濃度的SpdATPαS，但同時增加了相應濃度的無用的RpdATPαS。dATPαS被雙磷酸?降解後的產物是雙磷酸?的抑制劑，所以隨著反應進行，被雙磷酸?降解的dATPαS的降解產物濃度越來越大，雙磷酸?的活性越來越低。這可能是pyrosequencing技術測序長度很短，只能偵測20-30個核?酸序列的主要原因之一。新的革新就在於在反應體系中只加入SpdATPαS，這樣一來可以大大降低dATPαS降解產物的濃度，維持雙磷酸?較長時間的活性。目前這個革新可以使yrosequencing技術的測序長度增加最少一倍，達到50至100個以上的核?酸序列。

Pyrosequencing技術在mycobacteria鑑定之應用

Mycobacteria鑑定乃經由傳統之培養及生理、生化反應鑑定等。目前的方法並非最佳化，諸如引起肺結核的結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，其生長緩慢，經常要培養幾週才能得到足夠的菌體，供進行生理及生化反應鑑定。其檢測和鑑定費時，且敏感度與專
一度均不高，使得診斷與治療均受到影響。隨著分子生物學的發展，對於細菌的鑑定及分型便能提供比傳統方法更為準確的診斷方式。雖然目前對mycobacteria DNA的分析方法也有很多種，例如：定量PCR、雜交(包括基因晶片)、和以Sanger法為基礎的DNA序列分析等。其中只有DNA序列分析是黃金標準，如對16S rRNA和其它基因(如：hsp65、ESAT-6、CFP-10等)的序列分析，便可以用來診斷很多不同種，或同種但不同亞種/株系之mycobacteria。因此，利用PCR和pyrosequencing技術的序列分析，將可提供一個快速、簡單、可靠的細菌鑑定方法。此方法速度快，幾個小時即可得到結果，而且結果非常精確。

Pyrosequencing技術在SNP研究中的應用

除了DNA序列分析外，pyrosequencing還可以進行已知SNP的分析和SNP頻率確定。SNP研究大致分為兩個部分，一是SNP資料庫的建立，二是SNP之意義及功能之研究。在大規模基因組測序能力的研究單位中，依賴Sanger法測序，一種生物的所有SNP的資料庫便可建立起來。但還需加上每個SNP的功能研究，才有意義。對已發現的SNP的功能的研究包含SNP頻率分析，及SNP位點的核?酸種類的證實等。對於前者，pyrosequencing是這樣進行的：假設研究者手中有若干份來自不同個體的基因組DNA樣品，要檢測這些不同樣品的同一SNP的頻率，那麼研究者可以混合這些樣本的基因組DNA，然後做一次PCR，進行一次測序，研究者就可以得到該SNP在這些樣本中的頻率。如果研究者已經有了各個樣本的PCR產物，也可以將PCR產物混合後進行一次pyrosequencing，就可以知道該SNP頻率。如果是SNP位點的核?酸種類的證實，需要首先得到特定SNP所在的DNA片段，即PCR產物，然後在SNP位點的上游和/或下游設計測序引子，這樣便可透過對十幾個核?酸序列的測定，確定SNP位點的核?酸種類，以及SNP位點上下游十幾個核?酸的序列。

Pyrosequencing 在腫瘤基因甲基化研究的應用

甲基化研究對於基因的調控和腫瘤的發生有非常密切的關係。在一般正常的細胞中，基因調控區CpG island處於非甲基化的狀態。而當細胞發生癌變後，這些CG區域往往呈現甲基化狀態。腫瘤的發生，以及一些遺傳病的出現，和基因甲基化有非常密切的關係。Pyrosequencing技術能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，藉以了解那些DNA序列位點發生甲基化，每個位點的甲基化程度是多少，以及這些位點的甲基化和疾病的相關性等。

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